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• 发布时间：2009-02-02 16:26
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【概要描述】  　　固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的4倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。 　　甲醛 (HCHO)是一种无色易溶的刺激性气体。市售甲醛水溶液实际浓度为40%，易挥发，日久会自行分解，产生白色沉淀(副醛：多聚甲醛或三聚甲醛)，并有甲酸产生，使溶液呈酸性，影响细胞核的染色。我们用作固定的为10%甲醛水溶液(实际含甲醛4%，又称福尔马林液)。 　　优点： 　　1、 渗透能力强，固定均匀。 　　2、 收缩小。 　　3、 能保存脂肪和类脂体(冰冻切片法)。 　　4、 能增加组织韧性。 　　5、 有利于嗜银染色。 　　6、 对抗原保存良好。 　　缺点： 　　1、 溶解糖类和尿酸结晶。 　　2、 经甲醛固定的陈旧组织较易产生色素沉淀。(去除方法：用Schridde法：浓氨水1毫升加入75%酒精200毫升内，切片脱蜡后处理30分钟，如还有再延长，流水冲洗)。 　　酒精 CH3CH2OH，是一种还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾等氧化剂配成固定液。 　　优点： 　　1、 酒精有固定，硬化和脱水的作用。 　　2、 保存糖原可用100%酒精固定。 　　缺点： 　　1、 渗透力较弱。 　　2、 容易造成表面发硬，较难渗透到组织深部。 　　3、 核蛋白沉淀后仍能溶于水，导致核的着色不良。 　　4、 可溶解血红蛋白和损害多种色素。 　　苦味酸 2,4,6-三硝基苯酚，黄色晶体，易燃易爆，应制成饱和溶液贮藏。 　　能沉淀蛋白，也有软化组织的作用，还具有一定的脱钙作用，固定后的组织必须流水冲洗4小时以上才能脱水。一般与其它液体配合使用，如Bouin液：苦味酸85 ml，甲醛10 ml，冰醋酸5 ml。 　　重铬酸钾 K2Cr2O7 ,桔红色结晶，5%水溶液作固定用。可使蛋白质变为不溶性，不能沉淀蛋白质。但在溶液中加入醋酸后，也能使蛋白质沉淀。用未酸化的重铬酸钾固定，可保持与生活状态相仿，对线粒体、高尔基氏体的固定很好，而且其穿透力极强，组织收缩亦小。缺点是溶解染色质。固定后的组织必须流水冲洗12小时以上。 　　醋酸 CH3COOH 5%水溶液作固定用。不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白。渗透性强，固定快，能使组织膨胀。常与其它液体配合使用。 　　观点： 　　1、笔者认为，10%甲醛液由于受到甲醛的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响，浓度被降低致组织固定不足，而高浓度的甲醛，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。通过实践，本人认为以12～15%的甲醛最佳。大标本(2cm厚)一般需要6～12个小时，小标本一般需要3～6个小时;当室温低18℃时，可在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。由于HE染色最佳着色PH为3.5～4.5, 中性甲醛对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰,核染色质不佳。骨髓、结缔组织固定以Bouin液为佳，经Bouin液固定后的组织必须流水冲洗4小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液;少数单位还可建立组织冷冻库，以便适应各种特殊的处理要求。 　　2、经Bouin液固定的骨组织，如果脱钙不佳，还可再用10%硝酸脱钙，效果也不错。 　　3、有学者认为：“发灰”的主要原因是经中性甲醛固定后组织PH值呈弱碱性，不利于苏木素染液的结合。如能在染苏木素前调整组织切片的HP至酸性可改善染色效果。在脱蜡水化后把切片浸入3%的乙酸溶液内(PH值3.0)处理5分钟，流水冲洗5分钟，常规苏木素染色。用酸处理后可明显改善染色“发灰”现象，提高红蓝反差。但也有学者认为用酸处理后效果不明显。 　　4、甲醛可用作溶剂、防腐剂、还原剂。现代科学研究表明，甲醛对人体健康有负面影响。当室内含量为0.1毫克/立方米时就有异味和不适感;0.5毫克/立方米时可刺激眼睛引起流泪;0.6毫克/立方米时引起咽喉不适或疼痛;浓度再高可引起恶心、呕吐、咳嗽、胸闷、气喘甚至肺气肿;当空气中达到230毫克/立方米时可当即导致死亡。长期接触低剂量甲醛可以引起慢性呼吸道疾病、女性月经紊乱、妊娠综合症，引起新生儿体质降低、染色体异常，甚至引起鼻咽癌。高浓度的甲醛对神经系统、免疫系统、肝脏等都有毒害。它还可刺激眼结膜、呼吸道黏膜而产生流泪、流涕，引起结膜炎、咽喉炎、哮喘、支气管炎和变态反应性疾病。甲醛还有致畸、致癌作用。据流行病学调查，长期接触甲醛的人，可引起鼻腔、口腔、鼻咽、咽喉、皮肤和消化道的癌症。保持室内空气的流通和良好的换气，是病理科必不可少的条件。笔者认为，修建取材台时，抽气口做在台子下方，更利于甲醛气体的排出。 　　混合固定液 　　1、 Altmann液：用于固定线粒体，脂肪。固定时间约12-24h。 　　固定液配方：5%重铬酸钾水溶液10ml，2%锇酸水溶液10ml。 　　2、B-5固定液(醋酸钠-升汞-甲醛固定液)：多用于固定淋巴组织。在染色前，应进行脱汞处理。 　　固定液配方：无水醋酸钠1.25g，升汞6g，甲醛10ml(用时加入)，蒸镀馏水90ml。 　　3、B-4固定液：无水醋酸钠1.25g，升汞6g，蒸镀馏水100ml。在染色前，应进行脱汞处理。 　　4、Bouin液：是外科活检标本特别是骨髓、睾丸等组织固定的良好固定液。适用于结缔组织染色，尤其是三色染色时更为理想，组织细胞结构完整，细胞核着色鲜明，但细胞质着色较差。对脂肪的固定效果好，尤其适用于含脂肪的淋巴结，乳腺组织和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸，pH为3-3.5，对抗原有一定损害，使组织收缩，不适宜于标本的长期保存。固定时间12-24h。固定后组织被染成黄色，需要70%-80%酒精洗涤或流水冲洗。 　　固定液配方：饱和苦味酸水溶液：甲醛水溶液：冰醋酸=75：25：5。 　　5、 Carnoy液：固定胞浆和细胞核，对于染色体固定佳，显示DNA和RNA效果好。此液固定速度快，3mm厚的组织块1h固定左右，大块材料最好不要超过4h。 　　固定液配方：冰醋酸10ml，氯仿30ml，无水酒精60ml。 　　6、 Champy液 主要用于固定线粒体和高尔基复合体。该固定液穿透能力差，组织块应小。固定时间6-24h，固定后流水冲洗过液。 　　固定液配方：3%重铬酸钾70ml，1%铬酸70ml，2%锇酸40ml。 　　7、 Helly液 该液也称为Zenker福尔马林液。该固定液对细胞质固定较好，对某些细胞质内特殊颗粒、胰岛和垂体前叶各种细胞的显示及心肌闰盘保存有良好的效果。 　　固定液配方：重铬酸钾2.5g，升汞5g，蒸馏水100ml，甲醛5ml。 　　在染色前，应进行脱汞处理。 　　8、 Kanovsky液：适用于免疫电镜标本的前固定，对细胞抗原性和细胞微细结构的保存较戊二醛好。固定时一般先灌注，而后再浸泡固定10-30min，用缓冲液漂洗后，用蔗糖液浸泡后恒温冷冻切片。 　　固定液配方：25%戊二醛10ml，40%甲醛5ml，0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液49ml，无水氯化钙50mg，蒸馏水33.5ml，蒸馏水最后加入，pH约7.3。 　　9、 Kolmer液：用于眼球和神经组织的固定。固定时间24h左右。 　　固定液配方：5%重铬酸钾水溶液4份，10%甲醛4份，冰醋酸1份，三氯醋酸水溶液1份，10%醋酸钠水溶液1份。 　　10、 Metchcarn液：适用于某些癌基因蛋白产物和一些抗原的固定，固定时间：室温4-24h。 　　固定液配方：甲醇60ml，氯仿10ml，.醋酸10ml。 　　11、Romeis液：可作为一般固定液应用，也可用于其他固定液固定后的再固定。有利于Heidehain铁苏木精染色，有后媒染作用。 　　固定液配方：升汞饱和水溶液50ml，5%三氯醋酸水溶液40ml，甲醛10ml(临用时加入)。固定时间12-24h ，固定后入95%酒精脱水。 　　12、Rossman液：对糖原固定较好。固定12-24h后，固定后用95%酒精洗。纯酒精脱水。 　　固定液配方：无水乙醇苦味酸饱和液90ml，甲醛10ml。 　　13、Verhoeff液 用于固定眼球，固定48h后，即可脱水。 　　固定液配方：甲醛水溶液10ml，95%酒精48ml，蒸馏水36ml，苦味酸1g。 　　14、Zenker液：为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织，使细胞核和细胞质染色较清晰，常用于三色染色。对免疫球蛋白染色最好、病毒包涵体(如Negri小体)的固定效果较好。进行磷钨酸-苏木精染色的组织也应该使用该固定液。但对于含血量较多的标本不合适。固定时间12-36h，加热可加快固定作用。 　　固定液配方：储存液由重铬酸钾2.5g，升汞5g，蒸馏水100ml 组成，用时加入冰醋酸5ml。配制该液体时，可将重铬酸钾和升汞一起加入蒸馏水中，加温40-50℃溶解，冷却过滤后存于棕色瓶内。同时取此液95ml，加冰醋酸5ml即可。此固定液不能用金属容器盛放，组织固定后，也不能用金属镊夹取。如果此液中的冰醋酸用甲醛代替即为Helly液。在Zenker储存液中加入10ml甲醛水溶液，为Maximow液。 　　固定后流水冲洗12h去除重铬酸钾，或用亚硫酸钠溶液冲洗，也可用1%的氨水溶液洗涤。在70%酒精脱水时加入碘(配成0.5%碘酒)脱汞。 　　15、4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3)：该固定液适用于免疫组织化学方法。动物先用此液进行灌注固定，取材后，再用该液浸泡固定2-24h。 　　固定液配方：40g多聚甲醛，溶于1000ml，0.1mol/L的PB液，不容易溶解，放于密封瓶中，60℃温箱过夜即可溶解，也可以加温至60℃，搅拌溶解。 　　16、4%多聚甲醛-磷酸二钠/氢氧化钠液：该固定液适用于光镜和电镜免疫组织化学方法。用于免疫电镜标本时，应加入新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5-1%。此固定液性质温和，可长期保存组织。 　　固定液配方：甲液-多聚甲醛40g，蒸馏水400ml;乙液-NaH2PO4•2H2O16.88g，蒸馏水300ml;丙液-NaOH3.86g，蒸馏水200ml。先将甲液中多聚甲完全溶解，乙液倒入丙液混合后倒入甲液，用1mol/LNaOH或1mol/L HCL将pH调至7.2-7.4。补充蒸馏水至1000ml，充分混合后，4℃保存。 　　17、中性缓冲甲醛液：对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩小。固定时间以24h以内为宜。 　　固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。 　　固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠(NaH2PO4•H2O)4g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)13g。